Obsah

1. Úvod
2. Struktura nukleových kyselin
3. Struktura proteinů
   • Primární struktura
     • Seznam aminokyselin
   • Další proteinové struktury
4. Sequence alignment
   • Dotplot
   • Pairwise sequence alignment
     • Skórovací tabulky
     • Algoritmy
   • Multiple sequence alignment
5. Hledání v databázích
   • Algoritmy
     • FASTA
     • BLAST
     • Srovnání FASTA a BLAST
     • Parametry významnosti alignmentu
     • Profilové algoritmy
6. Analýza sekvencí
   • Hledání motivů
   • Další možnosti analýzy sekvencí
7. Databáze
   • Strukturní databáze
     • PDB
8. Strukturní alignment
   • Klasifikace proteinů
   • Predikce struktury
     • Intrinsically disordered proteins
     • Predikce sekundární struktury
     • Predikce membránových proteinů
     • Homologní modelování
     • Fold recognition
     • Ab initio predikce
     • Predikce interakce
9. Souvislost struktury a funkce
   • Hledání funkce
     • Solvent-accessible surface area
     • Enzymy
       • Speciální případy motivů
       • Detekce ligand-vazebných míst

Úvod

Bioinformatika je vědní disciplína, která se zabývá zpracováním biologických dat. Slovem “zpracování” dat máme namysli jejich sběr, archivaci, organizaci a interpretaci.

A jak velká? Například největší genom, patřící organismu Amoeba dubia, má 670GB. Stejně tak se v desítkách GB pohybují i 3D histologické skeny. EBI (European Bioinformatic Institute) měl v roce 2015 kapacitu 60 PB dat.

Struktura nukleových kyselin

Objev struktury DNA: Watson, Crick, Franklin (50. léta 20. století).

guanin

viz slide, běžná purinová báze

guanosin

nukleosid guaninu, tj. guanin + cukr vázaný N-glykosidickou vazbou

guanosin trifosfát

nukleotid guaninu, tj. guanosin + fosfát navázaný fosfodiesterovou vazbou

Struktura proteinů

Primární až kvartnerní; struktura určuje funkci proteinu (proto nás zajímá), například s čím reaguje, jakými membránami projde a za jakých podmínek atp. Další informace viz též zápisky z biopolymerů.

Primární struktura

Primární struktura je určená pořadím aminokyselin (AK). AK je 20+2.

Seznam aminokyselin

AK se dají rozdělit do několika skupin; nejdůlěžitější rozdělení je asi podle hydrofobicity, protože podle toho se poté jednotlivé AK vyskytují uvnitř nebo naopak na povrchu proteinů. Další významnou vlastností, která navíc s hydrofobicitou souvisí, je elektrický náboj.

Polární AK jsou hydrofilní, nepolární jsou hydrofobní.

Seznam aminokyselin a jejich rozdělení

Pro popis aminokyselin se někdy využívá i B (Asn/Asp) a Z (Gln/Glu). Kromě výše zmíněných dvaceti AK se vydělují ještě následující dvě.

pyrolysin

kódovaný UAG stop kodonem

selenocystein

kódovaný UGA stop kodonem, využíván pro určení struktury proteinů, je v řadě enzymů

Další proteinové struktury

Kromě primární struktury proteinu rozlišujeme ještě sekundární, teriární a kvarterní. Sekundární struktura proteinu je určena lokálními konformacemi jeho částí.

Kvarterní struktura proteinu popsiuje uspořádání několika terciárních struktur (například v dimerech).

Sequence alignment

Základní bioinformatická metoda užíváná k porovnání dvou sekvencí (DNA, proteinů). Obecně se jedná o nějaké seřazení sekvencí pod sebe. Dobrý alignment dvou sekvencí má však důležitou vlastnost: pod sebou jsou jednotky (nukleotidy, AK), které se vyvinuly ze stejného předka. Někdy byly určité jednotky v průběhu evoluce přidány nebo odebrány, což se v rámci alignmentu značí pomlčkami (viz níže).

Než se dostaneme k samotnému procesu alignmentu (tj. zjišťování, které jednotky a potažmo celé sekvence jsou evolučně spřízněné), ukážeme několik jeho praktických využití.

A je homolog B

A a B mají společného předka, jejich původní funkce však nemusí být zachována. Homologii můžeme (opatrně) odvodit z vysokého procenta sekvenční identity A a B (viz dále). Musíme však dát pozor na paralogii.

Na základě homologie můžeme (opatrně) odvodit funkční a strukturní podobnost. Například můžeme hledat homology problémových lidských proteinů v modelových organismech, na které budeme cílit vyvíjená léčiva.

A je ortolog B

Poddruh homologie; A a B vznikly speciací ze společného předka, jejich funkce by tedy měla být zachována.

A je paralog B

Poddruh homologie; A a B vznikly genovou duplikací ze společného předka—jejich funkce tedy nemusí být zachována (protože jedna kopie genu ji zastane, zatímco A a B se mohli vyvinout v něco jiného).

A je ohnolog B

Podobný vztah jako paralog, vzniká ale celogenomovou duplikací.

A je xenolog B

A a B vznikly horizontálním transferem (například mezidruhovým).

A je analog B

A a B mají podobnou funkci, avšak je to jen náhoda—společného předka nemají.

globální alignment

Srovnávání celé sekvence.

lokální alignment

Srovnávání pouze částí sekvence, vybírá kousky, které k sobě sedí nejlépe.

Snažíme se ze znalosti struktury a funkce určitého proteinu odvodit funkci jiného, podobného (homologního) proteinu. To, jestli je vůbec možné z kvantitativní veličiny sekvenční identity (SI) vyvodit kvalitativní rozhodnutí o homologii, zkoumali Chotia, Lest (1986) a Rost (1999). Zjistilo se, že změny ve struktuře jsou korelovány se změnami v sekvenci, neboli z %SI si můžeme troufnout odvodit homologii a podobné vztahy, a z nich poté hádat věci jako je funkce nebo evoluční původ.

Jakým způsbem se rozhodnout, když jsme v twilight zóně? Na to existuje několik triků.

Výše bylo zmíněno, že srovnávání sekvencí funguje jak pro proteiny, tak pro DNA. Přesto se ale častěji, minimálně k určování homologie, používají proteiny, a to ze dvou důvodů:

1. protože AK je dvacet, je menší šance, že budou na jednom místě dvě shodné AK náhodou (oproti čtyřem nukleotidům v DNA, kde je náhodná shoda pravděpodobnější)
2. různé kodony kódují stejné AK, čili určité změny v DNA kódu se vůbec nemusí projevit v jeho exprimaci; jinými slovy, i relativně hodně odlišné sekvence mohou kódovat stejné, nebo velice podobné proteiny

Srovnávání sekvencí DNA ale má svá uplatnění. Používá se v místech, která se v proteomu vůbec neobjeví; při zkoumání regulačních oblastní genů a definování genů a při celogenomovém srovnávání.

Metody jsou v zásadě dvě, dotploty, které slouží spíše k hrubému odhadu situace, a pairwise sequence alignment, což je aby se řeklo the real deal.

Dotplot

Nejpřímější a nejjednodušší metoda: do tabulky se zaznamenávají místa, na kterých jsou dvě sekvence shodné (viz slidy). Někdy se místo jednotlivých stavebních jednotek sekvencí používají celé domény na sekvencích.

Na dotplotu byly sledovány i první dvě známé struktury, hemoglobin a myoglobin.

V praxi se často používá self-dotplot, tedy dotplot, kde je sekvence srovnávána sama se sebou. Ten opět vyhledává symetrické úseky, repetice, odhaluje místa s nízkou komplexitou a palidromy.

Pairwise sequence alignment

Může samozřejmě probíhat i na DNA, pro jednoduchost jej ale popíšeme pouze na proteinech. Pro DNA funguje analogicky.

Předpokládáme, že sekvence A a B mají společného předka. Poté, když je srovnáme (naalignujeme) “pod sebe”, můžeme na každém jednotlivém místě pozorovat následující:

• shoda: AK v A i v B jsou na daném místě stejné
• neshoda: AK v A je na daném místě odlišná od AK v B
• mezera (gap): v jedné ze sekvencí došlo při vývoji od společného předka k inzerci nebo deleci

Proces alignmentu je vlastně proces umisťování mezer a pozorování toho, jak si poté dvě sekvence navzájem odpovídají. Příklad alignmentu:

1
2
3

VLSEGKTEAPV[...]
|||..    ||
VLSPA----PV[...]

Toto je další příklad alignmentu těchto sekvencí; tentokrát dosti nepovedeného:

1
2
3

---VLSEGKTEA--PV[...]
   .  ..
V-LS--PA----PV--[...]

Substituce jedné AK za jinou je pravděpodobnější než inzerce/delece. V rámci substitucí je pravděpodobnější substituce podobných jednotek (Val \(\leftrightarrow\) Leu, G \(\leftrightarrow\) A) než těch nepodobných (Trp \(\leftrightarrow\) Gly, G \(\leftrightarrow\) C).

K hledání optimálního (nebo suboptimálního) alignmentu používá algoritmus, který projde mnoho různých možných alignmentů a vybere z nich ten s nejvyšším skóre dle přidělené skórovací tabulky. Pozor, ani nejlepší alignment nemusí odpovídat reálu.

Skórovací tabulky

Neboli scoring matrices.

Tabulky jsou tedy symetrické—nejsme schopni z empirických dat zjistit, jakým směrem proběhla substituce (pokud máme na daném místě v jedné sekvenci Ile a v druhé Val, nevíme, které AK z těch dvou tam byla původně, a která tam bylo substituována dodatečně).

Výběr tabulky se snažíme přizpůsobit sekvencím, které srovnáváme, abychom získali co nejlepší výsledky; především rozlišujeme evolučně blízké sekvence od těch vzdálených. Krátké sekvence skórujeme podle tabulek pro krátký evoluční čas.

Algoritmy

Nejznámějším programem na hledání alignmentu je Clustal \(\Omega\) (kdysi Clustal W).

Multiple sequence alignment

Když srovnáváme více sekvencí najednou, je to sice složitější, ale má to několik velkých výhod:

1. výsledný alignment je přesnější
2. data z alignmentu se dají použít pro fylogenetické studie
3. máme větší šanci nalézt strukturně nebo funkčně významné AK
   • takové AK budou v sekvencích konzervované
4. alignment slouží jako základ pro studie funkce proteinu

Fylogenetický strom (dendrogram)

Hledání v databázích

Jak roste množství biologických dat, roste i nutnost umět v nich dobře vyhledávat; zpravidla se snažíme najít sekvenci podobnou nějaké jiné, kterou zrovna máme. Je tedy samozřejmé, že alignment je součástí procesu vyhledávání, a to často i lokální alignment (vyhledávání na základě podobných domén, motivů).

true positive (TP)

To, co jsme hledali a našli.

false positive (FP)

To, co jsme nehledali a přesto našli.

true negative (TN)

To, co jsme nehledali a nenašli.

false negative (FN)

To, co jsme hledali, ale nenašli.

Při vyhledávání je nutno brát ohledy na selektivitu a senzitivitu: obě tyto veličiny ale nelze optimalizovat zároveň.

senzitivita

Pravděpodobnost, s jakou budou nalezeny sekvence příbuzné k vyhledáváné sekvenci. Čím nižší je, tím méně skutečných výsledků program najde.

\[\text{senzitivita} = \frac{\text{TP}}{\text{TP} + \text{FN}}\]

selektivita

Pravděpodobnost, s jakou jsou nalezené sekvence příbuzné s vyhledávanou sekvencí. Čím nižší je, tím více nevýsledků se objevuje v rámci výsledku (\(\implies\) je těžší najít ve výsledcích zajímavé údaje).

\[\text{selektivita} = \frac{\text{TP}}{\text{TP} + \text{FP}}\]

Obdobné veličiny existují i pro analýzu nenalezených sekvencí.

specifita

Udává s jakou pravděpodobností nebudou nalezeny sekvence, které nejsou příbuzné s vyhledávanou sekvencí.

\[\text{specifita} = \frac{\text{TN}}{\text{TN} + \text{FP}}\]

negative predictive value (NPV)

Udává s jakou pravděpodobností budou nenalezené sekvence nepříbuzné s vyhledávanou sekvencí.

\[\text{NPV} = \frac{\text{TN}}{\text{TN} + \text{FN}}\]

Algoritmy

• tradiční algoritmy jsou příliš pomalé, využívají se heuristiky
  • vedou rychle k výsledku, který je blízko tomu optimálnímu
  • trocha přesnosti obětována pro rychlost
  • FASTA, BLAST
  • obě použitelné pro proteiny i DNA
• někdy se používá i machine learning
  • HMM (hidden Markov models)
  • profiling methods

FASTA

V 80. létech byl vyvinut algoritmus FASTA, který využívá globální alignment. Funguje následovně:

1. známé sekvence v databázi jsou rozděleny na krátké úseky o délce \(k\) a uloženy do vyhledávací tabulky
   • u proteinů \(k \in \{2, 3\}\)
   • u DNA \(4 \leq k \leq 6\)
2. na stejně dlouhé úseky je nyní rozdělena i hledaná sekvence
3. úseky z hledané sekvence jsou porovnány s úseky uloženými ve vyhledávací tabulce, jsou zaznamenány shodné úseky i jejich offsety
   • například úsek AB je v hledané sekvenci na začátku, ale AB ve vyhledávací tabulce začíná až na pátém místě, offset je tedy 5
4. nejlepší matche dvojic úseků jsou rozšířeny a oskórovány příslušnou skórovací tabulkou (bez mezer)
5. nejlepší takové úseky jsou naalignovány s hledanou sekvencí (tentokrát už s mezerami)
6. výstupem jsou sekvence z databáze, jejichž úseky mají celkově nejvyšší skóre

Z výše zmíněného vyplývá, jaká je největší nevýhoda FASTA algoritmu. Může se stát, že FASTA některé příbuzné sekvence nenajde—konkrétně ty, které s tou hledanou nemají \(k\) identit v řadě. Jsou totiž srovnávány úseky o délce \(k\) a v bodě 3. postupují jen úseky 100% shodné s nějakým úsekem hledané sekvence.

BLAST

V 90. létech následoval algoritmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), který funguje na bázi lokálního alignmentu.

Základní rozdíl oproti FASTA tkví v bodě 3. Nejsou vybrána pouze 100% shodná slova, nýbrž všechna slova, která dosáhnou určitého bodového ohodnocení.

Algoritmus BLAST se vyskytuje v několika verzích, mnohé z nich jsou na internetu, například zde.

Srovnání FASTA a BLAST

Existují také SSearch a GSearch, což jsou rigorózní globální/lokální alignmentovací algoritmy. Jejich běh trvá hodiny.

Parametry významnosti alignmentu

Z-score

Říká nám, jak moc je naše skóre odlišné od toho průměrného. \(\text{ZS} > 15\) je statisticky významné, pro \(5 \leq \text{ZS} \leq 15\) se pravděpodobně jedná o homology a při \(\text{ZS} < 5\) sekvence sice mohou, ale nemusí být homologní.

Postup výpočtu

1. uděláme alignment dvou sekvencí a zaznamenáme skóre
2. jednu sekvenci náhodně přeházíme
3. znovu uděláme alignment a zaznamenáme skóre
4. spočítáme průměr a standardní odchylku skóre

\[\text{Z-score} = \frac{\text{první skóre} - \text{průměr skóre}}{\text{standartní odchylka}}\]

P-value

Existují dvě různé definice, přičemž druhá z nich lépe odpovídá realitě a poskytuje lepší výsledky.

1. pravděpodobnost, že alignment nepříbuzných sekvencí (FP hit) bude mít stejné nebo vyšší skóre
2. pravděpodobnost, že bude stejného nebo vyššího skóre dosaženo náhodou

Rozdělení skóre není normální (podle Gaussovy křivky), ale odpovídá EVD křivce (extreme value distribution). Při normálním rozdělení by docházelo k přeceňování významu dosažených skóre.

Pro skóre \(S > x\) platí

\[\text{P-value} = 1 - e^{-e^{-\lambda (x - u)}},\]

kde

• \(u\) je charakteristická hodnota, \(u = Kmn / \lambda\)
• \(m, n\) jsou délky sekvencí
• \(K\) je konstanta
• \(\lambda\) je “decay factor”

\(K\) a \(\lambda\) se dají spočítat ze skórovací tabulky.

E-value

Předpokládaný počet náhodných (FP) sekvencí se stejným nebo vyšším skóre v databázi o dané velikosti. Udává něco jako šum, chceme tuto hodnotu tedy co nejnižší.

\[\text{E-value} = \text{P-value} \cdot \text{velikost databáze}\]

Cutoff skóre v BLASTu udává, kolik lze v databázi o dané velikosti průměrně čekat FP. Je to vlastně způsob vyvažování selektivity a senzitivity (nižší cutoff zvyšuje selektivitu).

Profilové algoritmy

BLAST přistupuje ke všem sekvencím stejně, existují ale i citlivější metody—profilové.

Zroku 1997 pochází PSI-BLAST (position specifix iterative BLAST). Oproti běžnému BLASTu používá position specific scoring matrix (PSSM), což je tabulka obsahující specifická skóre pro každou pozici v sekvenci.

Z roku 2009 je CS/CSI BLAST, context-specific iterative BLAST.

Poslední profilovou metodou jsou HMM, hidden Markov models.

Analýza sekvencí

Co dělat, když vyhledávání v databázích nepřineslo nic zajímavého? Jak přesto nějak využít sekvenci, kterou máme?

Aneb, ano, máme co dělat, i když nám MSA nic moc neprozradil.

Hledání motivů

profile

Kvantitativní popis toho, jak vypadá sekvence—udání vyskytujících se AK a frekvence výskytu. Většinou se jedná o domény.

pattern

Funguje podobně jako regex—udává, které AK se (ne)můžou vyskytovat na daném místě, případně kolikrát.

1 2	[STAIV]-{ERDL}-[LIVMF]-[LIVM]-D- -[DSTA]-G-[LIVMFC]-X(2,3)-[DNH]

AK jsou označeny jednopísmenným kódem, mezi jednotlivými pozicemi jsou pomlčky. V hranatách závorkách jsou AK vyskytující se na určité pozici, naopak ve složených jsou AK, které se na ni nevyskytují. Číslo v závorce udává počet pozic.

Pattern jako jediný dovede jednoznačně přidělit či vyloučit motiv.

Další možnosti analýzy sekvencí

Databáze

Databáze jsou strukturované soubory dat v počítači, které je možné prohledávat, měnit a ukládat. Zakládají se z důvodů organizace a zálohování dat, a proto, aby měl k datům kdokoli relativně jednoduchý přístup.

V databázích nejsou uložena jen data o proteinech:

• databáze DNA
  • GenBank, EMBL, DDJB
  • data si denně vyměňují, takže mají stejný obsah
• databáze proteinů
  • UniProt (tj. Swissprot + TrEMBL + PIR): lepší než americké databáze
  • SwissProt, GenPept, PRF
• genomové databáze (obsahují nukleotidové sekvence a mapování, z genové mapy umíme předpovědět funkci)
  • Ensembl, Sanger
• strukturní databáze (obsahují 3D struktury molekul)
  • primární: RCSB (USA), PDBe (EU), PDBJ (Japonsko)
    • pravidelně si vyměňují data
    • všechny tři výše zmíněné jsou součástí obecné PDB (protein data bank), která je spravována mezinárodní organizací Worldwide Protein Data Bank
  • “added-value” databáze: OCA, PDBSum
  • odvozené databáze, které hodnotí kvalitu dat: EDS, WhatCheck

Strukturní databáze

PDB

PDB (protein data bank) je strukturní databáze.

Soubory jsou v PDB uloženy ve formátu .pdb. Ten má dvě části; první popisuje, o jakou strukturu se jedná, druhá popisuje už samotnou strukturu (rozložení atomů a vazeb v prostoru). Ve sloupcích jsou pak zapsaná různá další data, viz slide. Temperature factor určuje plochu, kde se popisovaný atom vyskytuje; buďto důsledkem nepřesnosti našich měření, či jeho dynamikou.

V databázích nejsou uloženy jen struktury samotné, ale i daší doplňující informace, například:

• popis kvality struktury
• seznam strukturních motivů
• seznam 3D modelů celých proteinů i s ligandy

Existují ale nové strukturní formáty, jako mmCIF nebo XML, které jsou pro počítače dobře čitelné.

Strukturní alignment

Struktura proteinu je lépe konzervovaná, než sekvence—struktura totiž určuje jeho funkci, jejíž změna je jen zřídkakdy výhodná, naproti tomu i různé sekvence mohou mít podobnou strukturu, a tedy funkci.

Najít strukturní alignment je složité (NP-složité), navíc ani optimální alignment (podle nějaké naší metriky) nemusí odpovídat reálným biologickým poznatkům.

ad 1) Toto lze dělat několika způsoby:

• srovnáním pravidelných úseků sekundární struktury (SS), příapadně jen jejich začátků a konců
• srovnáním tabulek vzájemných vzdáleností (distance matrices) návzájem si odpovídajích atomů
• rozebráním struktury na jednotlivé motivy, z nichž každému je přiřazeno jedno písmeno, a přepsáním proteinů do této nové abecedy; textové sekvence motivů jsou poté srovnány běžným PSA (BLAST, Yakusa)

ad 2) Optimalizovány většinou bývají superpozice atomů. Superpozice je vzdálenost dvou \(\ce{C\alpha}\), která je pak přes všechny \(\ce{C\alpha}\) měřená jako RMSD (root mean square distance). Hledají se pak takové konformace/rotace, bylo RMSD minimalizováno.

kde \(d\) je (Euklidovská) vzdálenost dvou atomů \(\ce{C\alpha}\) a \(N\) je počet atomů \(\ce{C\alpha}\).

ad 3) RMSD je k hodnocení statistické významosti nevhodné, protože je to globální parametr citlivý na lokální změny a protože koreluje s délkou alignmentu. Existuje ale několik alternativ:

• SAS: řeší problém korelace hodnoty RMSD s délkou sekvence
  \[\text{SAS} = \frac{\text{RMSD}}{N}\]
• Z-score a E-value, viz para­me­try výz­nam­nos­ti align­men­tu
• TM-score: není závislé na délce, je citlivější (od 0=úplně jiné do 1=shodné)

Klasifikace proteinů

Strukturní alignment lze využít k tvorbě systému struktur (většinou podle domén). Takovýchto “opakovaných” struktur je konečné množství, proto se vyplatí je klasifikovat.

doména

Někdy je uvažována jako jednotka evoluce. Je globulární, při foldingu nezávislá na zbytku proteinu, má více kontaktů uvnitř sebe než se zbytkem proteinu. Může se vyskytovat i samostatně.

Jak je ze slidů vidět, skoro třetina známých super-rodin spadá do deseti foldovacích skupin. Konkrétně TIM barrel se často vyskytuje u struktur, které mohou mít mnoho různých enzymatických funkcí. Není to ale možno říct s jistotou, stejně jako u jiných složitých struktur.

Predikce struktury

Primární struktura (sekvence) proteinu bývá často určena experimentálně, můžeme se tedy pokusit predikovat vyšší struktury. Tato predikce nebývá příliš přesná, mívá tzv. confidence level, který udává, jak moc je odhad pravděpodobný.

Anfinsen ukázal (1973), že se ribonukleáza po denaturaci sama renaturuje tak, že je schopna vykonávat svou původní funkci a z toho usoudil, že veškerá informace potřebná pro zaujetí struktury je obsažena v sekvenci.

Určení struktury ze sekvence je ale výpočetně velice náročné a někdy to ani není možné.

Intrinsically disordered proteins

Proteiny (nebo jejich části), které nemají v nepřítomnosti vazebného partnera nebo ligandu pevnou sekundární a terciární strukturu.

V rámci proteinu jdou části bez pevné struktury často alespoň přibližně poznat, protože mají několik specifických vlastností.

Predikce sekundární struktury

Často chceme určit, který druh SS se v proteinu vyskytuje nejčastěji, případně na kterém místě je jaká SS, abychom podle toho mohli vylepšit alignment, či abychom dané informace využili při stavění kompletního 3D modelu proteinu. Druhy SS většinou rozlišujeme pouze tři: helix, list a “zbytek”.

SS propensity

Udává, v jaké SS se daná AK nejčastěji vyskytuje; to zjistíme z experimentálně naměřených dat.

\[\text{propensita } X \text{ k helixu} = \frac{\text{frekvence } X \text{ v helixu}}{\text{frekvence } X}\]

Trochu lepší výsledky než Chou-Fasman má metoda GOR, která sice také počítá propensities pro všech 20 AK na určité pozici, ale výpočty u ní závisí i na 16 okolních AK. Výsledná tabulka s čísly je tedy \(20 \times 17\), místo \(20 \times 1\).

Predikce membránových proteinů

Predikce je komplikována tím, že ne všechny helixy procházejí celou membránou: existují přerušované helixy, které jsou přerušeny uvnitř membrány, a reentrant loops, což jsou helixy, které se vrací zpět na stranu, ze které vyšly.

Beta barelům je věnována menší pozornost, jelikož je jich málo a jsou často bakteriální či mitochondriální.

Homologní modelování

Homologní modelování umožňuje predikci 3D struktury proteinu na základě evoluční příbuznosti (homologie) s proteinem, jehož strukturu už známe (templátem). Ta je většinou stanovena pomocí sequence alignmentu.

Předpokládáme, že určitý sekvenční motiv má dobře známou strukturu, a není tak důvod, aby podobný protein se stejnou sekvencí měl úplně jinou strukturu.

ad 1. Nalezení příbuzných proteinů) Hledáme ve velkých databázích (pomocí BLAST, FASTA, PSI-BLAST), nejlépe včetně strukturních (PDB, pomocí HMM). Nevhodný templát nám zkazí celou budoucí práci, proto je důležité volit dobře.

ad 2. Výběr templátu) Obecně čím vyšší %SI, tím lepší daný templát je.

Lze vybrat i více templátů, nebo použít různé templáty pro různé části proteinu.

ad 3. Alignment) Toto je nejdůležitější část celého procesu. MSA algoritmy předpokládají, že jsou jejich proteiny homologické, proto je důležité dobře volit templát, aby vzniklý model nebyl nesmyslný.

Je dobré alignment ručně upravit (pokud například známe konzervovaná aktivní místa), případně k jeho tvorbě využít znalost SS. Zbytek informací viz MSA.

ad 4.1 Model building) Na základě alignmentu můžeme vytvořit 3D model sekvence; záleží hlavně na kvalitě templátu, existující programy a modelovací postupy se přesností příliš neliší. Počátečním modelem bývají SS templátu, ve kterých se poté doplňují nebo upravují AK.

Model je nutné nějak zkontrolovat; nikdy ale nebude zcela odpovídat pravdě. Časté chyby (množství a závažnost roste s klesající %SI): chybný rotamer či pozice AK, chyby v oblastech s nedostatečnou homologií (smyčky), chyby v alignmentu.

ad 4.2 Model evaluation) Modely se hodnotí jednodušeji než alignmenty, proto se často na chybu přijde až v této fázi. Nejlepší je použít WhatCheck, který zkontroluje celou škálu veličin, které nás zajímají.

WhatIf a Modeller vyžadují větší zkušenosti, jsou ale věrohodnější.

Fold recognition

Fold recognition metody používáme, když neumíme najít templát se známou strukturou, který by byl homologní k naší sekvenci. Snažíme se najít nehomologní proteiny, které přesto mají alespoň část své struktury shodnou s částí struktury naší sekvence. V tom nám pomáhá to, že dovolených foldů je omezené množství a stejné foldy se často opakují (na 130000 známých strukturách je jen 1375 různých foldů)—pokud uvažujeme nějaký protein bez detekovatelného %SI, ze 70–80% bude mít fold, který už je známý.

Existují dva základní postupy, které se liší svou metodikou i úspěšností: profile a threading metody.

Na rozdíl od profile metod se threading metody nesnaží ze známých struktur vytvořit profily (3D \(\rightarrow\) 1D), ale naopak chtějí z naší sekvence získat nějaké informace o struktuře (1D \(\rightarrow\) 3D).

Threading metody jsou sofistikovanější než profile metody a přináší lepší výsledky (například program Threader2). Alfa proteiny (proteiny s více helixy než beta listy) se predikují lépe než beta proteiny, protože alfa helixy tvoří lokální vodíkové můstky, zatímco beta listy tvoří vodíkové můstky spíše mezi AK, které jsou od sebe v sekvenci více vzdálené.

Ab initio predikce

Homologní modelování ani fold recognition nemohou uspět, pokud má protein zcela nový fold. Když hledáme takovýto nový fold, řešíme vlastně nejobecnější problém foldingu (hledání struktury pouze se znalostí dané sekvence).

Předpokládáme, že správně nafoldovaný protein bude mít nejnižší energii; náš problém tedy převedeme na problém hledání struktury s nejnižší energií.

Jeden z nejlepších nástrojů pro predikci struktur je Rosetta. \(\ce{C\alpha}\) RMSD je méně než 1,5Å mezi modelem a experimentálně určenou strukturou. Rosetta kombinuje fragmenty, používá NMR a energetické funkce.

Predikce interakce

Proteiny, které spolu interagují, se obvykle vyvíjejí společně a synchronně; mutace v jednom z proteinů jsou kompenzovány mutacemi v druhém. Používá se proto in silico dvouhybridní systém: udělá se MSA obou proteinů a pokud vykazují podobnou frekvenci mutací, může se jednat o interakční pár.

Souvislost struktury a funkce

Ze sekvence proteinu lze (s omezenou přesností, viz předchozí část) odvodit jeho strukturu. Podobně lze, opět s omezenou přesností, z jeho struktury odvodit jeho funkci.

Hlavní paradigma tedy zní: podobná sekvence \(\iff\) podobná struktura \(\iff\) podobná funkce.

Existuje databáze Gene Ontology, která ukládá definované atributy genů a proteinů; popisuje proteiny na třech úrovních: molecular function, biological process, cellular component.

Bohužel, hlavní paradigma ne vždy funguje; jeden protein (jedna struktura) může mít více různých funkcí a jedna funkce může být splněna několika různými strukturami.

Hledání funkce

• analýza kvarterní struktury proteinu
  • často ji neznáme, protože struktury proteinů nejsou vždy určeny ve své nativní konformaci, musíme ji tedy odhadnout
  • zjistíme, zda protein funguje jako monomer, dimer, atd.
  • provedeme analýzu intermolekulárních kontaktů
  • nástroje PQS, PISA
• fold comparison se známými strukturami
  • hledání podobné struktury v databázi
  • funguje na základě strukturního alignmentu, tedy i pro sekvence s nízkým %SI
  • program LSQMAN
• kombinace strukturních a evolučních metod
• hledání 3D motivů
  • motivy lze automaticky extrahovat z dobře anotovaných struktur
  • hledání odpovědi na otázku: objevuje se alespoň jeden z takových motivů v nové struktuře?
    • programy JESS, PINTS
  • definování libovolnyého strukturního motivu
    • pogram SPASM
  • “reverse templates” - rozsekání struktury na motivy a hledání podobných fragmentů v databázi
    • program SiteSeer
• kombinace výše uvedených, například server ProFunc

Solvent-accessible surface area

Solvent-accessible surface area (ASA) je metoda, kterou se zjišťuje “povrch” proteinu (viz slide).

Enzymy

Zjišťování funkce enzymů je pro vědce běžně nejdůležitější. Práci nám někdy ulehčuje to, že určité motivy či části sekvencí se vyskytují pouze ve spojitosti s určým ligandem nebo konkrétní fukncí.

Speciální případy motivů

Motivy obecně bývají spíše vzácné, protože jsou energeticky nevýhodné; když už tedy v proteinu jsou, je to často v jeho aktivním místě (kde jsou nezbytné).

Detekce ligand-vazebných míst

Pokud najdeme podobnost v ligand-vazebných místech dvou různých proteinů, dá se předpokládat, že váží podobné ligandy a mají podobnou funkci. Vazebná místa proto popisujeme matematickými metodami—získáme real sphere harmonic coefficient—a srovnáváme tento koeficient mezi proteiny.

promiskuita

Jev, kdy se některé ligandy (např. ATP, NAD) na proteiny vážou v mnoha různých konformacích, viz slide.

virtual screening

Bioinformatická metoda, jejímž cílem je odhadnout, jak dobře se daná nízkomolekulární sloučenina váže na protein; lze ji tedy v principu využít k predikci ligandů pro danou strukturu. Pro svou funkci používá docking (viz níže).

Je využívána farmaceutickými firmami, které navrhnou mnoho takovýchto látek, pro všechny udělají virtual screening a z nich vyberou několik nejlepších kandidátů, kteří půjdou do dalších testů.

docking

Molecular docking je proces, který se pokouší nalézt nízkoenergetické vazebné módy dvou molekul (obvykle proteinu a jeho ligandu, případně dvou proteinů). Je to spíše chemická ne bioinformatická metoda.

Někdy lze k predikci vazebných partnerů využít i strukturní informace.