Obsah

1. Stavba hmoty
   • Kvantově-mechanický model atomu
     • Schrödingerova rovnice
   • Periodická soustava prvků
   • Molekuly
     • Chemická vazba
     • Hybridizace orbitalů
2. Stavba proteinů
   • Aminokyseliny
     • Disociace AK
     • Další vlastnosti AK
   • Peptidová vazba
   • Sekundární struktury
3. Metody pozorování proteinů
   • Spektrofotometrie
     • Spektrofotometrie v praxi
   • Cirkulární dichroismus
   • Gelová elektroforéza
     • Gel
     • SDS
     • Barvení
   • Fluorescence
4. Nové zápisky v metodách
   • ELFO proteinů
   • Sekvenace proteinů
5. Struktura nukleových kyselin
   • Stavební jednotky
   • Struktura
     • Hoogsteenovo párování
   • Reaktivita bazí
6. Polymorfismus DNA
   • Konformační polymorfismus
     • Konformace B
     • Konformace A
     • Konformace Z
   • Sekvenční polymorfismus
   • Dynamický polymorfismus
   • Ohyby a zalomení
   • Další konformační anomálie
   • Vsuvka: konformace RNA
   • Topologie DNA
     • Supercoil
       • Levotočivost a pravotočivost
       • Superhelix a replikace
     • Topoizomerázy
     • Zkoumání topologie DNA
7. Elektroforéza nukleových kyselin
   • Princip funkce pro DNA
   • Příprava
   • Průběh
     • Rozdělení topoizomerů DNA
     • Pulzní ELFO
   • Analýza ELFO
8. Sedimentační metody
   • Fyzikální princip
     • Sedimentační koeficient
   • Izopyknická a izokinetická ultracentrifugace
   • Preparativní a analytická ultracentrifugace
     • Průběh AUC
     • Praktické využití AUC
9. Sekvenace DNA
   • Metody se štěpením DNA
     • Původní metody
     • Chemické štěpení
   • Metody se syntézou DNA
     • Metoda terminace (Sanger)
     • Pyrosekvenování
       • Odhalování metylace
       • Pyrosekvenování 454
     • Sekvenace nanopóry
     • Další metody
10. Nezařazené poznámky

Stavba hmoty

• hmota se dělí na pole a látky, ale všechny formy látky mají dualistický charakter
• látky se skládají z atomů, které mají obal a jádro
  • proton: \(1,673 \cdot 10^{-27} \text{kg}\), náboj \(+e\)
    • \(e = -1,602 \cdot 10^{-19} \text{C}\)
  • elektron: \(9,109 \cdot 10^{-31} \text{kg}\), náboj \(-e\)
  • \(1,675 \cdot 10^{-27} \text{kg}\), o trochu těžší než proton

nuklid

Látka, která se skládá z atomů jednoho prvku, které mají stejné nukleonové číslo (A).

izotop

Atomy jednoho nuklidu v rámci směsi více nuklidů jednoho prvku. Všechny izotopy mají stejné chemické vlastnosti, liší se ale svou hmotností a tedy i rychlostí reakcí. Někdy se používají se někdy u chemického značení, např. radioaktivního.

U radioaktivity je důležitý i rozpadový zákon, který říká, kolik atomů radioaktivní látky budeme mít za určitou dobu.

kde \(\lambda\) je přeměnová konstanta. Tu můžeme spočítat například pokud známe poločas rozpadu naší látky, protože

Zavádí se i veličina aktivita [Bq], která udává počet radioaktivních přeměn za sekundu.

Kvantově-mechanický model atomu

V tomto modelu se projevuje korpuskulárně-vlnový dualismus elektronů. Aplikuje se Heisenbergův princip neurčitosti—nemůžeme současně detekovat hybnost i polohu částic. Proto se k popisu částic používají probabilistické metody.

Schrödingerova rovnice

Rovnice, která popisuje částice pomocí vlnové funkce \(\psi\). \(|\psi|^2\) pak udává pravděpodobnost toho, kde se daná částice nachází. Velikost atomu nemůžeme přesně určit, většinou se spokojíme s prostorem, kde se elektrony vyskytují s 99% pravděpodobností.

\(\psi\) vyjde jako řešení Schrödingerovy rovnice, těchto řešení je nekonečně mnoho (liší se například tím, jakou energii daná částice má). Řešení popisujeme třemi čísly, která se nazývají kvantová.

• \(n\), hlavní kvantové číslo, odpovídá energii částice
  • \(E = -B/n^2\), kde \(B =\) \(\pu{13,6 eV}\)
  • \(n = 1\), atom je v základním stavu, \(n > 1\), atom je v excitovaném stavu
• \(l\), vedlejší kvantové číslo, udává moment hybnosti elektronu
  • hodnoty 0 až \(n-1\)
  • udává tvar orbitalu (prostoru), ve kterém se elektron nachází
• \(m\), magnetické kvantové číslo, udává prostorovou orientaci orbitalu
  • hodnoty \(-(n - 1)\) až \(n-1\)

Periodická soustava prvků

• rozdělení podle protonového čísla, tedy podle počtu elektronů a tedy podle chemických vlastností
• dělení prvků podle toho, jaké valenční orbitaly se zaplňují jako poslední: s-prvky, p-prvky (i d-prvky a f-prvky)
• nejstabilnější stav orbitalů je u vzácných plynů, tzv. oktetové pravidlo
• prvky pod sebou mají podobné vlastnosti
• se Z se mění určité veličiny
  • roste atomový poloměr
    • v rámci periody je nejvyšší pro alkalické kovy
    • paradox: s obsazováním už zčásti obsazeného orbitalu se atomový poloměr zmenšuje
  • klesá ionizační energie, tedy energie kterou musíme dodat, abychom odštěpili elektron
    • v rámci periody je nejvyšší pro vzácné plyny
  • elektronová afinity klesá v každé skupině periodické tabulky s rostoucím atomovým číslem a roste v každé periodě s růstem atomového čísla
    • energie která se uvolní, když atom přijme elektron

Molekuly

molekula

Stálé seskupení atomových jader obklopených elektrony; tvoří samostatnou částici. Vazby mezi jednotlivými atomy se dají zrušit jen chemickou reakcí. Elektronová struktura vázaných atomů se liší od elektronové struktury volných atomů.

Molekuly dělíme na homonukleární a heteronukleární.

Chemická vazba

disociační energie

Energie, která se uvolní při přerušení chemické vazby. Je stejně velká jako vazebná energie, která vyjadřuje, jaký je pokles energie oproti stavu, kdy dva atomy vázány nejsou.

• při vzniku dochází k takovému přeskupení elektronů reagujících atomů, které vede ke snížení celkové energie soustavy
• energie, která se uvolní při rozpadu vazby, se nazývá disociační
• vaznost atomu
  • C má vaznost čtyři
  • N, P tři
  • O, S dva
  • H jedna
• elektrony, které ve valenční vrstvě chybí jednomu atomu, mu mohou být “doplněny” druhým atomem

Hybridizace orbitalů

Kombinování AO, vhodné pro popis vazeb a prostorového uspořádání. Například u C se zkombinují (po excitaci) \(2s\) a \(2p\) orbitaly do tzv. \(sp^3\) hybridizace.

Protože \(s\) má nějakou danou fázi, původně symetrický \(p\) který je s \(s\) nyní zkombinovaný, bude najednou asymetrický; strana se stejnou fázi jako původní \(s\) bude v \(sp^3\) větší. Proto tvoří C pravidelný čtyřboký jehlan s úhly 109.5° mezi C a H.

Uhlík může mít i hybridizaci \(sp^2\) (které se neúčastní všechny tři \(2p\) orbitaly, ale pouze dva z nich). Například v ethenu, kde vzniká dvojná vazba, jeden uhlík je v \(sp^2\) a druhý z \(p\). \(\sigma\) vazba vzniká v \(sp\) orbitalech, \(\pi\) vazba vzniká na původních \(2p\) orbitalech. Podobně existuje i \(sp\) hybridizace, která se vyskytuje při vzniku trojné vazby.

Stavba proteinů

Proteiny se skládají z aminokyselin (AK), pro více informací o struktuře proteinů a jednotlivých AK viz struktura NA a struktura proteinů v zápiscích ze základů bioinformatiky.

Je velice složité počítat se všemi těmito vazbami, když se například snažíme konkrétní protein namodelovat. Práci nám stěžuje i to, že kolem jednoduchých vazeb je možná rotace a vibrace (měnění délky vazby), takže proteiny jsou v čase dynamické.

rotamery

Dvě AK, které mají stejné chemické složení, ale ve svém R-řetězci se liší rotací v nějaké z jednoduchých vazeb. Pokud je rozdíl v úhlech veliký, můžu se liší vlastnosti obou AK.

Aminokyseliny

• amfoterní charakter (\(\ce{NH2}\) a \(\ce{COOH}\) si navzájem předají vodík), vzniká amfion, někdy také zwitterion
• dělí se na nepolární, polární a nabité polární

Seznam aminokyselin a jejich rozdělení

• dva cysteiny spolu tvoří sulfidický můstek
• všechny proteiny (alespoň hned po translaci) začínají na Met, u bakterií je to N-formylmethionin
• AK mo­hou být mod­i­fikovány (oligosacharidy, sul­fa­ti­zace, es­ter­i­fikace, fos­fory­lace, ami­dace, atd.)
• průměrná hmot­nost AA je \(\pu{110 g/mol}\)
• existuje i několik vzácných AK
  • selenocystein, pyrrolysin, N-formylmethionin
  • jsou kódovány STOP kodony

Disociace AK

Měříme poměr koncentrací nedisociovaných a disociovaných kyselin.

kde \(K_a\) je takzvaná disociační konstanta. Pokud přidáme nějakou kyselinu do vody, pH se časem ustálí na \(\text{pK}_a\) kyseliny.

Definujeme také izoelektrický bod AK, což je bod, kdy kyselina nemá žádný náboj. Počítá se jako průměr jednotlivých \(\text{pK}_a\) všech možných forem AK, podle toho, který z vodíků je odštěpený. Pro vodík v \(\ce{COOH}\) je \(\text{pK}_a \approx 2\), pro ten v \(\ce{NH3}\) \(\text{pK}_a \approx 10\).

Další vlastnosti AK

Hydrofobicita udává, jako moc je protein hydrofobní; značí se \(R\), a má kladné hodnoty pro hydrofobní proteiny.

Peptidová vazba

Vazba mezi dvěma AK, které se účastní původní \(\ce{COOH}\) a \(\ce{NH2}\) skupiny.

Vazba je planární, protože dvojná vazba \(\ce{C=O}\) někdy přejde na vazbu \(\ce{C-N}\) (tzv. mezomerie). Rotace je tedy možná pouze v “rozích” vazby, kolem vazeb vycházejících z \(\ce{C\alpha}\).

Sekundární struktury

Metody pozorování proteinů

Spektrofotometrie

Světlo: viditelné elektromagnetické záření. Pro spektrofotometrii (zde dále SFM) proteinů je vhodnější UV záření.

Konkrétní znění zákona se dá vyjádřit vzorcem \begin{align*}T &= \frac{I}{I_0} \\ A &= -\log T = \varepsilon \cdot l \cdot c,\end{align*} kde \(I\) a \(I_0\) značí inzentity světla, \(T\) je transmitance vzorku, A je absorbance vzorku a \(\varepsilon\) je molární extinkční koeficient. Pokud již známe absorbanci naší látky, můžeme pomocí tohoto vzorce například spočítat jejich koncentraci.

Spektrofotometrie v praxi

SFM je nedestruktivní metoda, což je její velká výhoda.

Proteiny dobře absorbují světlo kolem \(\pu{225 nm}\) (tam absorbuje peptidová vazba) a případně i kolem \(\pu{280 nm}\), když mají nějaké aromatické AK. Všechny AK absorbují různě moc, takže pokud známe složení proteinu a vidíme absorpční spektrum vzorku, umíme z něj vypočítat koncentraci. \(\varepsilon\) pro jakýkoli protein o známé sekvenci se totiž dá dopočítat.

Nukleové kyseliny zpravidla absorbují kolem u{260 nm}. U nukleových kyselin se SFM užívá například k posouzení stupně a průběhu denaturace, nebo k posouzení homogenity. Pro sekvence DNA a RNA se koncentrace stanovuje trochu jinak,

Pro dsDNA \(K = 2\), pro ssDNA \(K = 2,5\), pro ssDNA \(K = 3\), pro oligo DNA \(K = 3,3\) až \(K = 5\).

Cirkulární dichroismus

lineární polarizace světla

Udává rovinu kmitání elektrické vlny světla. Běžné světlo není polarizované, i když při odrazu k částečné polarizaci dochází.

Ke změně polarizace můžeme použít polarizační filtry, které propustí pouze světlo, které kmitá v jedné konkrétní rovině.

cirkulární polarizace světla

Pokud v polarizovaném světle zpozdíme kmitání magnetické složky, například o čtvrt vlny, výsledný světelný vektor, který je součtem vektoru elektrického pole a vektoru magnetického pole, se bude postupně při kmitání otáčet.

Rozlišujeme pravotočivou a levotočivou polarizaci.

Absorbce cirkulárně polarizovaného světla záleží na chiralitě molekul a na levotočivosti a pravotočivosti světla. Cirkulární dichroismus je rozdíl mezi absorbancí levotočivě a pravotočivě polarizovanho světla.

Cirkulární dichroismus jednotlivých SS se liší, viz obrázek. Podobně se liší CD pro protein s nějakým foldem a pro denaturovaný protein. Pokud změříme CD proteinu, můžeme z výsledné spektrální křivky zjistit procentuální podíl jednotlivých SS.

Hodnota cirkulárního dichroismu pro různé sekundární struktury

Gelová elektroforéza

Pomocí ELFO můžeme zjistit velikost proteinu, odhalit počet proteinů nebo odhalit kontaminaci vzorku. Nejběžnější forma je SDS-PAGE, SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza.

Musíme zařídit, aby byl gel tak akorát hustý, a aby všechny vzorky opravdu putovaly na stejnou stranu gelu (ke stejné elektrodě). Zároveň by bylo dobré nakonec vzorky nějak obarvit, ať je vůbec vidíme.

Protože nechceme proteiny dělit podle jejich tvaru, ale jen podle velikosti, povaříme je před ELFO v denaturačních činidlech.

Gel

Polyakrylamidový gel je sice velice náročný na přípravu, má ale výborné rozlišovací schopnosti: například při dělení DNA lze rozpoznat DNA dlouhou 500bp od 501bp.

• polykarylamidový gel, nejčastěji 3%–15%
• akrylamid \(+\) bisakrylamid
  • vzniknou zesíťovaná vlákna
  • aby proběhla radikálová polymerace, potřebujeme také iniciátor (persíran amonný nebo UV-ozářený riboflavin) a stabilizátor volných radikálů (TEMED)
  • musí probíhat v anaerobních podmínkách
• jeho viskozita zajišťuje, že velkým molekulám je při pohybu kladen větší odpor než malým
  • tato konkrétní vlastnost záleží na jeho koncentraci, pro různé vzorky se používají různě koncetrované gely
  • pro srovnání velmi rozdílných vzorků se používají gradientové gely, jejichž hustota se seshora dolů zvyšuje

Na tento gel se nanáší ještě zaostřovací gel, přechod mezi ním a PAG pak tvoří jakousi “startovací linii”, na kterou se seřadí a vyrovnají porovnávané vzorky.

SDS

SDS (sodium dodecyl sulfát) se váže na proteiny. Velké proteiny vážou více SDS než malé proteiny. SDS má dvojí význam:

1. zabraňuje tomu, aby se proteiny samovolně opět nafoldovaly
2. má záporný náboj, který “přebije” náboj proteinů a všechny proteiny tím pádem budou putovat ke kladné elektrodě
   • větší proteiny sice budou taženy větší silou, ale zase budou více brzděny gelem

Barvení

Proteiny chceme samozřejmě nějak vizualizovat, aby nám ELFO vůbec k něčemu byla.

Intenzita proužku vypovídá o tom, jak moc koncetrované jsou v daném místě proteiny. Zároveň ale platí, že malé proteiny se obarvují hůře, takže nebudou tak výrazné.

Fluorescence

fluorescence

Světlo emitované atomem po absorbci elektromagnetického záření. Energie fluorescence pochází z přechodu částice z prvního excitovaného stavu \(S_1\) do základního elektronového stavu \(S_0\). Délka fluorescence je v řádu nanosekund.

Schéma fluorometru: na fluoreskující vzorek svítíme monochromatickým paprskem, měříme emisní spektrum.

Schéma fluorometru

Z emisních spekter Trp můžeme poznat, v jakém prostředí (solventu) se nachází a jestli je uvnitř či na povrchu proteinu. Posun k červené oblasti (ale stále v rámci UV) ukazuje na přítomnost \(\ce{H2O}\).

Nové zápisky v metodách

• chceme znát i více věcí než je nstrukturu
• koncentrace, mol.hmotnost, sekvence (introny x exony–sekvenace proteinů), SS, rozměry a tvar molekuly
• až po těchto věceh zjistíme 3D strukturu
• a až poté řešíme interakce mezi proteiny, dynamiku a mechanismus sbalování

== KONCENTRACE proteinů - spektrofotometrie: 280 / 220 nm - kolorimetrie - biuretová reakce a Cu(II) vazba na 4N - Lowry: biuret a Folinovo reagens - BArdfordová: Coomassie Blue G250 - denzitometrie, porovnání se standardem na ELFO

=== biuretová reakce [slide] - biuret je kondenzát močoviny - umí koordinovat reakci s Cu - podobná reakce/koordinace probíhá i na polypeptidu, němělo by záležet na konkrétní AK sekvenci - Cu se dá chelatovat pomocí BCA, tvoří komplex, který absorbuje velmi silně

coomassie brillienat blue G-25 - přidává molekule záporný náboj - zabarvuje se podle toho, se kterou částí proteinu reaguje - nedá se používat v přítomnosti detergentů

== SS + 3D Struktura - různé druhy, závisí na torzních úhlech - pouze na základě záměn AK můžeme získat mnoho různých struktur (SS, TS) - elektrostatické síly, H můstky, hydrofobní interakce, disuflidové vazby

== PRÁCE S PROTEINEM 1) produkce proteinu - kdysi z původního zdroje - nyní rekombinantně (kvasinky, e. coli) - není úplně dobré dělat eukaryot. proteiny v bakteriích - můžeme získat mutantní formy - můžeme přidat afinitní značky, pomocí kterých můžeme protein “vychytávat” - důležitá je stabilizace (chlazení, nepřítomnost proteáz, případně vychytání proteáz pomocí speciálních nerozdělitelných peptidů)

SOLUBILIZACE [slide] - vsolování, u všech proteinů to zvyšuje rozpustnost, protože bývají více stíněny náboje AK na povrchu, už se netvoří agregáty proteinů - vysolování, odebírání vody - organická rozpouštědla - detergenty, denaturační činidla (ale nebudou v nativní konformaci) - změna pH, pro každý protein je ideální pH s vyšší rozpustností

=== CHROMATOGRAFIE - pokud chceme proteiny přečišťovat 1) ionexová chromat - podklad - pevný, nerozpustný - intoy z podkladu (A, K) jsou vyměňovány za ionty v rotozku (B, C) - Anex, Katex [ZE SLIDU] - protein - polyelektrolyt - vazba anexu nebo katexu podle pH a pI - kompetice s ostatními ionty v roztoku

- volba vhodných podmínek pro vazbu - nechceme vázat kontaminující proteiny - výběr podmínek pro uvolnění z nosiče - druhý krok selekce (zbavení se protilátek) - vazba na kolonu - můžeme preotin neustále vázat a uvolňovat - můžeme sbírat jednotlivé frakce

[slide schématu ionexové chromat.]

- ionexů je mnoho, liší se inertními materiály, ze kterých jsou vyrobeny

2) hydrofobní chromat - hydrofobní zbytky AK jsou umístěny uvnitř proteinů - malá část je exponována do vnějšího prostředí - vazba na silně hydrofobní povrch - RPC—chromatografie s obrácenými fázemi (protein už tozmotaný) - HIC—hydrofobní chromatografie

HIC - nosičem je agaróza (SPA) + hydrofobní skupiny (fenol, oktyl) - slabé hcydrofobní interakce - eluce - klesajíím gradientem solí - stoupajícím gradientem detergentů - stoupajícím pH - proteiny nejsou denaturované - rozdělují se podle nativní hydrofobicity

RPC - nosič - imobilizovaná nepolární kapalina - alkylové řetěce - fenyl-silika - silné hydrofob. interakce - eluce - hydrofobními látkami (organic. tozpouštědla) - protein je denaturován

3) afinitní chromat - agaróza aktivovaná bromkyanem, navázání nejrůznějších ligandů - ukotvení ligandu na inertní nosič na koloně - máme látku, která se vážěe na kolonu a zároveň fúzuje s naším proteinem - oplach kontaminací - odmytí cílového proteinu - jiným ligandem s vyšší afinitou - pH, iontová síla, teplota

jedna z metod: his-tag - komplex 6 His zařazený na konci proteinů (N/C - záleží na tom, jestli ji tam chceme nechat) - na histidinovou vrstvu se naváže nikl (AP, HRP), Ni je ligand - pokudp přidáme imidazol, protein se [TODO CO UDĚLÁ]

druhá z metod: biotin [slide] - vysoce afinitní vazby mezi bioitem a avidinem - více druhů avidinu, streptavidinů, neutravidinu (ty jsou odvozeny z avidinů) - naváže se avidin na protein, pak avidin s proteinem na biotin v koloně - někdy se ale váže biotin přímo na nějako uAK

další z metody: GST - glutation-S-transferáze - plazmid ze ktrerého exprimujeme protein - TODO dna wtf?

4) chromat na hydroxyapatitu - kompex H3PO4 a Ca - váže anionty díky kladným nábojům Ca, ale i kationty díky H3PO4 - dobře váe preoteiny - můžeme proteiny proplachovat, například od lipopolysacharidu, který mi tam zůstal z producenta (bakterie)

5) [to sem nepatří] HPLC [TODO doplnit z přednášky]

6) gelová filtrace (trochu patří do chromat) [slide x2] - dělení podle velikosti a tvaru molekul - stacionární fáze: kuličky hydratovaného gelu - velké molekuly proteinů budou putopat mimo kuličky gelu, malé molekuly budou vstupovat do gelu - velké molekuly půjdou nejrychleji - Vcelkový = Vkuliček + Vmrtvý - konkrétní látka má konstantní poměr Veluční / Vmrtvý - vylučovací limit je Mw nejmenší molekuly, která neprojde gelem - distribuce rozdělení pórů v gelu \(\implies\) rozdělení podle rychlosti

7) molekulová filtrace - [TODO DOPLNIT Z přednášky]

ELFO proteinů

- sds page dělí proteiny podle velikosti/hmotnosti - nativní PAGE dělí podle náboje, někdteré proteiny do gelu nevstoupí (CN - clear native) - [slide] 20kDa až 1200kDa, gradientový gel - preoteiny nejsou denaturované, mohou tvořit komplexy - alternativa je BN (blue native), je tam nadbytek coomassie blue, které dává proteinu záporný náboj, ale nedenaturuje ho (na rozdíl od SDS)

2D ELFO - koupený gel s gradientem pH - proteiny se budou pohybovat gelem tam, kde bude pH odpovídat jejich pI - izoelektrická fokusace: proteiny putují do velcie úzkých zón - normálně by se rozdělily taky, ale ne do úzkých zón - tento gel se dá položit kolmo na další gel [slide] - proteiny putují z fokusovaných prožků a rozdělí se podle moleulová hmotsnoti - [TODO doplnit z přednášky něco u 2D ELFO o gelech]

BARVENÍ GELU - coomasiia je nejčastější - opáchneme SDS vodou - barvíme 1h, hnědá \(\rightarrow\) modrá - je nutné odbarvit methanolem, octovkou, vodou - stříbro - velice citlivé - váže se na různé AK - vyvoláme Ag+ \(\rightarrow\) Ag0, získáme hnědočernou barvu - během vyvolávání se používá formaldehyd, glutaraldehyd - kovalentní modifikace proteinů, proteiny se nedají dál použít - zinkem - velmi citlivé, negativní barvení - imidazol váže zinek (i nikl btw), elý gel je bíle opalescentní - kde jsou proteiny, gel zůstane průhledný - fluorescenční - nejčastější nekovalentní - SYPRO - barvení v ejdnom kroku, bex fixace, bez odbarvování - intenzita flouorescence roste lineárně s množstvím

[TODO doplnit od fluorescenčních až po kvalitu]

HODNOCEÍ KVALITY PROTEINŮ - jak zjistit, jestli při práci s proteinem nedošlo k nějaké chybě - sds-page: je protein fragmentován - wester blot - pje náš proten opravud ten, který myslíme? (protilátky) - NMR spektrum fingerprint - cirkulární dichroismus - DLS (TODO: co to je?) - chromatografie:

Sekvenace proteinů

- někdy se stane, že DNA sekvence nepřechází celá do proteinu - důležitá pro krystalografii, protože ta musíme znát přesnou sekvenci abychom z krystalu něco vyčetli - umožňuje odvození SS - odhalení dědičných poruch a dispozic k onemocněním

příprava na sekvencai [TODO doplnit]

nalezení koncových AK - pomocí exopeptidáz, štěpíme protein z jednoho nebo druhého konce (nejlépe pro <5 posledních AK) - C koncová AK - karboxypeptidáza A a B, z hovězího pankreasu - ale neštěpí určité AA - sledujeme růst koncentrací AK v rotozku, podle pořadí toho, jak se mění, odhadujeme pořadí kocnocývh AK

Struktura nukleových kyselin

DNA a RNA se skládají z bazické, cukerné a fosfátové části. Páteř tvoří cukr (ribóza, deoxyribóza), který se střídá se zbytky kyseliny \(\ce{H3PO4}\).

Stavební jednotky

Základním cukrem je ribóza a deoxyribóza. Základní strukturní vlastnosti cukrů jsou však předvedeny na glukóze.

V NA tedy nacházíme β-D-ribofuranózu, a to buďto endo nebo exo formu. Samozřejmě v DNA je deoxy- varianta tohoto cuktu, viz slide. OH skupina má vliv na reaktivitu, DNA je proto mnohem stabilnější než RNA.

Cukr s fosfátem (navázaným přes fosfodiesterovou vazbu) tvoří tzv. cukrfosfátovou kostru NA.

Dusíkaté báze nukleových kyselin

Struktura

• vlákna v DNA jsou antiparalelní, jedno je ve směru 3’\(\rightarrow\)5’ a druhé 5’\(\rightarrow\)3’
• zaujímají strukturu dihelixu (Watson, Crick)
  • difrakční obrazec spirály má tvar X

Nukleosid, nukleotid

Názvolsoví nukleotidů a nukleosidů je trochu zmatené:

• adenin - adenosin
• cytosin - cytidin
• guanin - guanosin
• thymin - thymidin
• uracil - uridin

Tautomery nukleotidů

Tautomery nukleotidů

U všech bazí můžeme pozorovat takzvané tautomery, konkrétně amid/imid a keto/enol formy. Přestože jsou amidové a keto formy častější, musíme při práci s NA počítat s tím, že semtam mohou mít některé báze i imidovou a enol stavbu.

Hoogsteenovo párování

Běžné Watson-Crickovo párování je postavené na tom, že spolu párují pouze AT, CG, a všechny puriny jsou v antiklinální podobě. K párování ale může docházet i když jsou puriny v synklinální podobě (zvláště u adeninu, cytosin by musel mít kladný náboj).

Hoogsteenovo párování

To znamená, že puriny jsou “na druhé straně” schopny párovat s ještě jednou bazí. Vznikají takzvané triády.

Někdy se do běžného DNA helixu vmezeří třetí strand, který se na jedno z vláken naváže H-párováním. Toto třetí vlákno musí mít tzv. polypurinovou část, aby tuto vazbu mohlo vytvořit. Podobně se může mezi vlákna DNA vmezeřit i vlákno RNA.

Reaktivita bazí

• reakce jsou stejné jako u jiných heterocyklických sloučenin
• výjimka: pyrimidiny někdy reagují s podobnou molekulou
  • u pyrimidinů je \(\ce{C5=C6}\) podobná izolované dvojné vazbě
  • naříklad thyminový dimer (viz slide)
  • při působení UV záření
• výjimka: alkylace purinů na \(\ce{N7}\) destabilizuje glykosidickou vazbu a vede k depurinaci

Většinu bazí můžeme brát jako aromatické molekuly. Součástí interakce bazí jsou tedy i stacking interakce napříč patry.

Polymorfismus DNA

Je ale třeba si uvědomit, že pokud využíváme k detekci anomálií protilátky, můžeme se nám stát, že danou strukturu naší protilátkou stabilizujeme v jedné konkrétní konformaci, i když přirozeně by ji často měnila. Protilátky tak nemusí vždy odrážet realitu.

Konformační polymorfismus

Jedna molekula DNA bude mít v různých prostředích různou konformaci. Konformací existuje celá řada (A–Z, s různými indexy).

Existují tři hlavní rodiny konformací: A, B a Z.

Konformace B

• nejběžnější
• pravotočivá spirálovitá struktura
  • spirálovitá proto, že jednotlivé báze vlastně nechtějí být přesně nad sebou
• patra jsou vzdálená 330~350pm, působí mezi nimi stacking interakce
• fosfáty vzdálené kolem 9Å
• C1’ uhlíky v rámci patra jsou v každém patře skoro stejně daleko od sebe
• ribóza je C2’ endo (C2’ je na stejnou stranu jako C5’)
• rozlišení velkého a malého žlábku
  • důležité pro vazby molekul
  • mnoho proteinů reagujících s DNA funguje jako homodimer reagují s DNA na dvou místech
    • tyto proteiny kromě toho bývají bazické
  • do malého žlábku se váže např. molekula DAPI, která se používá k barvení
• uprostřed helixu není žádné místo

Konformace A

• pravotočivá spirálovitá struktura
• ribóza je C2’ exo, C3’ endo
• uprostřed helixu je dutina, která bývá vyplněna vodou
  • někdy se stane, že dvě báze spolu interagují prostřednictvím molekuly vody

Podobnou konformaci zaujímá i heterokomplex DNA+RNA, protože OH skupina cukru z RNA musí čnít ven z helixu, tedy C2’ musí být exo.

Konformace Z

• levotočivá spirálovitá struktura
• kostra uspořádaná cik-cak
  • v sekvenci se střídají puriny a pyrimidiny
    • puriny jsou synklinální, jejich riboza je tedy přetočená a kostra vypadá cik-cak
• patra jsou si strukturou podobná ob jedno (v B jsou si podobná všechna), repetitivní je dvojice párů bazí nad sebou
• některé modifikace bazí (například methylace na C5’) Z konformaci stabilizují (methyl se dobře schová mezi dvě patra)
• převládají báze G a C

Sekvenční polymorfismus

Báze v rámci patra nejsou v rovině, ale zaujímají tvar asymetrické vrtule. Stejně tak jednotlivá patra spolu nejsou rovnoběžná, ale různě nepravidelně natočená, protože si navzájem přkážejí.

Natočení a posun bazí je různý u různých konformací DNA, a závisí také na místním nukleotidovém složení. Zajímavě se například chovají poly-AT regiony.

Se sekvencí se nemění pouze posun bazí, ale i možné torzní úhly. Na slidu jsou znázorněny torzní úhly dvou polyadenylylových úseků s různými majoritními nukleotidy.

Dynamický polymorfismus

DNA je neustále v pohybu. Jak moc a jakým způsobem záleží především na konkrétní sekvenci.

• nedá se sledovat na krystalech, musíme použít NMR nebo například fluorescenci
• jedná se vlastně o časově a prostorově lokální denaturaci
• pokud například DNA-B přechází v DNA-Z, jedna báze se může vyklopit z řetězce (flipování)
  • často proto, že reaguje s nějakým enzymem

Ohyby a zalomení

K ohybům dochází v DNA hlavně na základě sekvenčního polymorfismu a na hranici dvou konformací. Naopak k zalomení především v důsledku mechanického namáhání nebo při vazbě na zakřivený povrch.

Další konformační anomálie

• lokální úseky Z-DNA, H-DNA, A-DNA, 4s DNA (uvnitř molekuly B-DNA)
• při výskytu palindromu, kde je jeden úsek DNA komplementární s nadcházejícícm úsekem na stejném vlákně, někdy na DNA vznikne kříž
• kromě kříže vlásenky, bubliny
• utajená přerušení: jedno vlákno je na kostře přerušené
  • nejsou problém, vlákna u sebe drží velkou silou
  • začíná u nich denaturace
• gapy: místa, kde chybí nějaká báze
• zlom s adhezivními (lepivými) přesahujícími konci: vlákno se lepí na vlákno podobného tvaru, nezáleží ale na jejich původu; adhezivní konce umožňují vytvářet genetické změny v DNA, můžeme je míchat

Vsuvka: konformace RNA

Podobně fungují i enzymy štěpící RNA, je proto relativně složité je zastavit (např. u DNA stačí jen odebrat z roztoku kovy, které enzymy potřebují k rozložení DNA).

V ribozomálním RNA jsou někdy celé sítě různých interakcí mezi nukleotidy.

V RNA je možných mnoho různých druhů párování.

Topologie DNA

DNA má strukturu dihelixu, viz výše. Topologie DNA se zabývá tím, jaký tvar tento dihelix zaujme v prostoru.

supercoil

Supercoil je termín, který popisuje přetočení nebo podtočení dihelixu DNA, které je vyústěním nějakého vnitřního tlaku, který na vlákna působí. Supercoil vzniká například v bakteriálním plazmidu. DNA v přírodě se většinou vyskytuje právě v této formě.

Supercoilu se říká také superhelix, nadobrátkám někdy terciární vinutí (běžné Watson-Crickovské je sekundární).

Znázornění nadobrátek

relaxovaná pozice

DNA je v relaxované pozici, když nemá žádné nadobrátky. Relaxovaná cyklická DNA (například plazmid) se označuje jako CO forma ()

twisting number (T)

Udává počet překřížení dvou vláken DNA, která jsou spolu v dihelixu. DNA je před spočítáním \(T\) nejprve vyrovnat do plochy. Znaménko udává, jestli je helix pravotočivý (\(+\)) nebo levotočivý (\(-\)).

V běžných podmínkách u lineárních B-DNA bývá \(T = 10\) na každých 106bp, protože B-DNA má jednu otočku na přibližně 10.6 párů bazí.

Znázornění nadobrátek

writhe number (W)

Udává počet nadobrátek, v přírodě (u bakteriálních plazmidů) bývá \(W = 1\) na 200bp. Nadobrátky mohou vyústit ve dvojí typ topologie: DNA zaujme buďto toroidální tvar, nebo plektonemní tvar. Plektonemnímu tvaru se někdy říká dvojitá nadšroubovice.

Poznámka

Toroid je těleso, které vzniklo rotací nějakého tvaru kolem jedné osy. Uprstřed toroidu je díra (například donut je druh toroidu). Plektonem je v překladu “zkroucené vlákno” a vypadá spíše jako řetěz.

Srovnání toroidu a plektonemy

Znaménko udává, jestli je superhelix pravotočivý toroid (\(+\)) nebo levotočivý toroid (\(-\)). Pravotočivý toroid je matematicky totožný s levotočivým plektonemem a naopak, tedy levotočivý plektonem má znaménko (\(+\)).

linking number (L, Lk)

Shrnuje předchozí dvě čísla, je to hlavní způsob, jakým se popsiuje topologie DNA.

\[L = T + W\]

Pokud se budeme bavit o plazmidu, můžeme říct, že po úvodním spojení konců DNA, kde vznikne cyklická DNA, je \(L\) konstantní. Úbytek otáček v helixu tedy bude znamenat příbytek nadotáček, a naopak.

Supercoilování, nebo obecně změna \(T\) a \(W\) čísel, může někdy způsobit (nebo alespoň podpořit) změnu konformace DNA, více viz slide.

Supercoil

DNA bývá velice dlouhé, buňka ho chce samozřejmě vměstnat na co nejmenší plochu—s tou podmínkou, že bude stále možné čtení DNA kódu, případně replikace. A právě tento problém supercoil řeší. Supercoil se mimo to významně podílí i na procesech replikace a transkripce, protože usnadňuje přístup proteinů k sekvenci DNA (viz níže).

Velikost supercoilu (počet nadobrátek) se měří: \begin{align*}\Delta L &= L - L_0 \\ \sigma &= \frac{\Delta L}{L_0},\end{align*} kde \(L_0\) je \(L\) relaxované DNA. \(\sigma\) se nazývá superhelikální hustota a představuje počet přidaných/ubraných nadotáček vzhledem k původnímu počtu nadotáček.

Víme, že DNA je ve své nejčastější konformaci pravotočivé. Nabízí se otázka: jak je to se superhelixem u bakterií?

Levotočivost a pravotočivost

Teoreticky by mělo být jedno, kterou z těchto dvou forem supercoil zaujme: obě budou kompaktní, což je jeho hlavní účel. V praxi se to ale liší.

• pravotočivý supercoil utahuje pravotočivou DNA ještě více, než je utažená běžně
  • výslednou DNA prakticky není možno rozplést
• levotočivý supercoil naopak DNA trochu povolí
  • DNA se supercoilem sice zkompaktní, ale obě vláknou jsou kolem sebe namotaná volněji, než předtím
  • dobře dostupné pro enzymy, proteiny atd.

Zdá se, že je výhodnější levotočivá forma. To bylo potvrzeno následujícím experimentem:

Superhelix a replikace

• při replikaci se rozplétají vlákna
  • klesá \(T\), roste \(W\), superhelix se “zauzlovává”
  • je nutné nějak supercoil zase oduzlovat, protože jinak by brzo nemohla replikace probíhat: buďto je nutné nějak aktivně odstranit nové kladné nadobrátky, nebo je nutné mít připravené záporné nadobrátky, které se s těmi nově vznikajícími kladnými vyruší
• u bakterií se zauzlování řeší připravováním záporných nadobrátek

O tvoření záporných nadobrátek se stará protein HU, který má podlouhlou, spirální strukturu.

K podobnému jevu dochází i při transkripci.

Topoizomerázy

Enzymy ovlivňující topologii DNA.

TOPOI i TOPOII umožňují i spojení (katenaci) dvou samostatných CO, úplně stejným postupem, jakým fungují běžně.

Zkoumání topologie DNA

Elektroforéza nukleových kyselin

ELFO se dělá jak pro DNA, tak pro RNA. V tomto textu se soustředíme sice pouze na popis DNA ELFO, ale pro RNA bude vše fungovat velice podobně.

Funkce podobná ELFO proteinů, s tím rozdílem, že NA se dají rozdělit nejen podle velikosti (hmotnosti), ale také podle topologie.

Princip funkce pro DNA

• DNA má v neutrálním a bazickém prostředí záporný náboj
  • konkrétně jeden záporný náboj na jeden bp
• DNA vždy míří ke kladné katodě, není potřeba žádná molekula SDS ani nic podobného

Na každou molekulu DNA působí elektrická síla

kde \(E\) je intenzita elektrického pole a \(q\) je náboj molekuly. Působí na nic však také třecí síla gelu

kde \(v\) je rychlost pohybu molekuly a \(f\) je koeficient tření gelu a DNA. Po dosažení rovnovážného stavu tak platí

Někdy se zavádí speciální veličina pohyblivost, pro kterou platí

tedy dává do vztahu rychlost molekuly a sílu elektrického pole.

Protože má DNA jeden náboj na bp, je poměr mezi hmotností a nábojem DNA kostantní—to znamená, že větší DNA je sice těžší (což ji zpomaluje), ale je zároveň silněji přitahována k anodě (což ji zrychluje), čili výsledkem by mohla být konstantní rychlost putování pro všechny DNA. Naštěstí mají menší fragmenty DNA menší koeficient tření, takže se přeci jen dají na ELFO rozeznat.

Příprava

ELFO se provádí v kapilárních systémech gelů, které částečně blokují difúzi do stran a zaručují tím, že nebudeme mít proužky příliš rozmazané. Nejčastejji se používá agarózový gel, popřípadě polyakrylamid.

Průběh

Průběh ELFO záleží na velikosti molekul, které pozorujeme.

1. molekula je velice malá (menší než 300bp–400bp, což je velikost molekuly agarózy): kategorie Ogstonova síta
   • bude procházet mezi molekulami gelu bez omezení rychlosti
   • rychlost pohybu není závislá na délce
2. molekula je středně velká: kategorie entropické pasti
   • v této oblasti je závislost pohyblivosti na velikosti molekuly nejsilnější
3. molekula je dlouhá, ale lineární
   • molekula se protáhne a provleče mezi molekulami gelu
   • rychlost pohybu opět není závislá na délce
   • například denaturovaná DNA

Na obrázku lze vidět porovnání délky molekuly a rychlosti, s jakou putuje v gelu. Snažíme se vždy, aby u námi pozorovaných molekul i malý rozdíl v déle způsobil velký rozdíl v rychlosti, protože poté i málo rozdílné molekuly půjdou dobře rozeznat. Vlevo na obrázku vidíme výsledek po 1D ELFO, kde nám spývají různé topoizomery. Po 2D ELFO jdou tyto topoizomery dobře rozlišit.

Dělení molekul při ELFO

Rozdělení topoizomerů DNA

Rychlost putování DNA závisí kromě velikosti molekuly i na jejím tvaru.

• ocDNA se pohybuje vždy nejpomaleji
• relativní rychlost cccDNA a lineární DNA závisí na hustotě gelu a napětí
  • řídký gel + nízké napětí: více se uplaňuje kompaktnost cccDNA
  • hustý gel + vysoké napětí: více se uplatní flexibilita lineární DNA
  • pohyblivost cccDNA navíc závisí na její nadšroubovicové hustotě

Může se nám stát, že chceme rozdělit vzorky podle velikosti i podle topologie. Bohužel velká lineární DNA může putovat stejně rychle jako menší coDNA, obě by tudíž skončily na stejném místě a nebyly rozeznatelné. Proto se někdy používá 2D ELFO.

Někdy ani nepoužijeme EtBr a druhou osu ELFO vytvoříme pouze aplikací vyššího napětí. Mobilita při vyšším napětí se liší podle topologie, což nám dovoluje jednotlivé topologie rozlišit.

2D ELFO pro sloužící k rozeznání topologie

Pokud nám naopak na rozdělení podle topologie nezáleží a chceme DNA dělit pouze podle velikosti, můžeme ji denaturovat.

Pulzní ELFO

• elektrické pole se periodicky mění, molekuly neputují gelem přímo, ale cik-cak
• používá se pro lepší rozlišení molekul podle délky, hlavně u delších molekul
  • dráha, kterou molekuly ujdou, je mnohem delší, takže i drobné rozdíly v jejich rychlosti mají větší možnost se projevit
  • molekuly se často musejí reorientovat, a jak rychle a dobře to zvládají závisí na jejich délce
• jako standardy se často používají konkatemery známých genomů bakteriofágů o určitých délkách, případně chromozomy S. cerevisae a S. pombe (druhy kvasinek)
  • stadard je sekvence o určité délce, která nám pomáhá odhadnout délku zkoumaných sekvencí (podobně dlouhé ekvence skončí po ELFO blízko standardu)

Analýza ELFO

Sedimentační metody

Sedimentace slouží k analýze a případné separaci vzorků na základě jejich velikosti, molekulové hmotnosti, tvaru a hustotě. Funguje na principu odstředivé síly, jejíž velikost je závislá na hmotnosti každého ze vzorků—sedimentace tedy zpravidla probíhá v centrifuze. Teorie centrifugace byla vypracována Svedbergem.

Zkumavku (kyvetu) se snažíme mít z nějakého odolného materiálu. Často se musíme vypořádat s tím, že molekuly u kraje kyvety o kyvetu třou a jsou pomalejší.

Fyzikální princip

Na vzorek v kyvetě působí tři síly, odstředivá

kde \(\omega\) je úhlová rychlost, \(r\) vzdálenost od osy otáčení a \(m\) hmotnost tělíska; dále vztlaková

kde \(m_k\) je hmotnost kapaliny tělískem vytlačené; a konečně třecí

kde \(f\) je frikční koeficient tělíska a kapaliny. \(f\) se dá vypočítat s pomocí Stokesova zákona (pokud je tělísko kulové) nebo s pomocí Einsteinova zákona

kde \(D\) je difúzní koeficient biomakromolekuly. Pkud tedy známe \(D\), jsme schopni \(f\) dopočítat, a \(D\) se dá naštěstí zjistit experimentálně (závisí na tvaru a objemu molekuly).

Pro přehlednost zavádíme také veličinu relativní odstředivá síla

která udává, kolikrát je odstředivá síla na ultracentrifuze větší než tíhová síla. Gravitační (tíhovou) sílu můžeme zanedbat, protože RCF se pohybuje ve stovkách tisíc.

Sedimentační koeficient

Pokud \(F_o = F_{vz} + F_t\), nastane stacionární stav.

\begin{align*}F_o - F_{vz} &= F_t \\ V \rho r \omega^2 - V \rho_k r \omega^2 = f \cdot v &= f \cdot \frac{\text{d}v}{\text{d}t} \\ \frac{V (\rho - \rho_k)}{f} = \frac{1}{r \omega^2} \frac{\text{d}v}{\text{d}t} &= s\end{align*}

\(s\) se nazývá sedimentační koeficient a udává se ve Svedberzích, \([S] = 10^{-13}\text{s}\). Pokud má tělísko 30S, pak urazí \(\pu{3 \mu m/s}\) při sedimentačním zrychlení \(\pu{1e6 ms-2}\). Sedimentační koeficient dává do souvislosti rychlost sedimentace se zrychlením, kterým na tělísko působila centrifuga.

Pokud k \(s\) přidáme korekce, získáme sedimentační konstantu.

1. vhodná korekce na nulovou koncentraci biopolymeru
   • molekuly spolu interagují s čímž normálně nepočítáme
   • počítáme, jak rychle by asi sedimentovala jedna molekula samotná
2. korekce na tlakové rozdíly
   • extrapolace na hladinu, protože blíže ke dnu je velký hydrostatický tlak

Její hodnota zálěží na koncentraci biopolymeru, teplotě, a použité kapalině; značí se poté například \(S_{0, 20, \text{w}}\).

Izopyknická a izokinetická ultracentrifugace

Koncentrační rozložení CsCl a DNA před izopyknickou UC a po ní

U izopyknické UC záleží na hustotě CsCl, která by většinou být někde mezi vzorky, aby se mohly lépe oddělit.

Preparativní a analytická ultracentrifugace

Preparativní ultracentrifugy slouží pouze k oddělení jednotlivých složek vzorku. Jednotlivé centrifugy se liší druhem rotorů, které mají různý tvar a různé naklonění zkumavek. Vzorky se z kyvet po separaci odebírají injekční stříkačkou.

Analytické ultracentrifugy (AUC) mají kromě rotoru také zařízení, které v průběhu centrifugace měří různé veličiny vzorku (koncentraci a podobně).

Průběh AUC

Když polymer dáme na hladinu a sedimentujeme, v průběhu centrifugace se pohybuje zkumavkou ke dnu takzvané rozhraní. Pozorujeme koncentrace v celé délce kyvety: na začátku bude koncentrace všude stejná, ale časem se koncenrace zvyšuje směrem ke konci kyvety. Pokud bude látek více, uvidíme několik rozhraní.

Na prvních derivacích koncentračních křivek jde vidět peaky. Nejprve můžeme pozorovat tyto peaky v čase pro jednu látku, pak pro druhou, a pak pro obě dohromady. Pokud v tomto případě vidíme kromě původních dvou peaků i nějaký nový, tvoří naše látky nějaký komplex. U tohoto komplexu můžeme pozorovat difúzní koeficient (“jak jsou peaky rozlité”) i sedimentační konstantu.

Ukázka analýzy sedimentace

Molární hmotnost můžeme vypočítat ze Svedbergovy rovnice

Praktické využití AUC

Zajímá nás, jakým způsobem funguje replikace u bakterií.

1. pěstujeme e. coli v atmosféře s těžkým dusíkem
2. po čase ji přesuneme do běžné atmosféry

Když po každém kroku změříme sedimentační koeficienty DNA, zjistíme, že na začátku byl helix těžký, poté vykazoval známky hybridního složení, a časem byl spíše lehký. Z toho (hlavně z druhého měření) je možno odvodit, že je replikace u bakterií semikonzervativní.

Sekvenace DNA

Přečtení kódu DNA. Existuje mnoho různých metod, základní postup je ale společný (skoro) všem z nich. Poslední dobou je sekvenace rutinní záležitost, levná a relativně rychlá.

shotgun sequencing

Termín, který popisuje postup sekvenace, který byl nastíněn výše: osekvenuje se mnoho krátkých fragmentů DNA s náhodnou délkou, které potom počítač přečte (získá ready) a složí dohromady.

Jakýmsi protikladem tohoto postupu je metoda primer walking, která prochází DNA popořadě, a je tím pádem sice jednodušší, ale také pomalejší.

next generation sequencing

Někdy také high-throughput sequencing—umbrella term pokrývající všechny moderní metody sekvenování DNA. Cílem je rychlost (paralelizace), přesnost a nízká cena.

Většina sekvenačních postupů se liší už v provedení bodu 1: jak získat z dlouhého DNA kratší fragmenty. Rozlišujeme metody, při kterých štěpíme už existující DNA, a metody, kdy si sami syntetizujeme kratší kousky DNA podle původní DNA.

Metody se štěpením DNA

Zpravidla jsou to metody starší, které se v dnešní době už tolik nepoužívají.

Původní metody

Původní metody pracovaly hlavně s RNA, protože ta se štěpí snadněji. Využívaly štěpení přírodními látkami, konkrétně

• fosfodiesterázou hadího jedu (od 3’ konce)
• fosfodiesterázou z hovězí sleziny (od 5’ konce)

V současné době už nepoužíváme hadí jed, ale jsme schopni připravit stejně velké kusy DNA pomocí restrikčních endonukleáz. Existují ale i nové sekvenační postupy, které fragmenty s určitou přesnou délkou nepotřebují.

Chemické štěpení

DNA je štěpená na náhodně dlouhé kusy, někde uprostřed.

Na podobném principu funguje štěpení před G + A, ale probíhá při pH 4. Samozřejmě takové štěpení nám přinese více fragmentů než štěpení před G.

Pozorujeme pouze strandy, které začínají na označeném 5’ konci.

• rozdělíme produkty štěpení podle hmotnosti na PA gelu (70°)
  • jen pár pásků bude radioaktivně označených
• jsme omezeni počtem asi 100 fragmentů, a navíc samozřejmě nejsme schopni nasekvenovat označený 5’ nukleotid

Metody se syntézou DNA

Metoda terminace (Sanger)

Na rozdíl od sekvenačních metod štěpících nějaké stávající DNA na menší fragmenty funguje tento postup trochu obráceně; pomocí DNA polymerázy vytváří komplementární vlákno k sekvenovanému vláknu, a v průběhu této in vitro syntetizace dochází k samotné sekvenaci. Je to metoda vhodná hlavně pro malé vzorky.

ddNTP máme čtyři druhy, a ty jsou buďto fyzicky oddělené v nádobách, nebo fluorescečně označené v jedné nádobě. Skončíme tedy se čtyřmi skupinami fragmentů DNA, které jsou všechny ukončeny určitou ddNTP a my víme, kterou (buďto podle nádoby, nebo podle barvy). Stačí nám zjistit, jak dlouhá jednotlivá vlákna jsou a můžeme z nich složit celou sekvenci.

Délku jednotlivých fragmentů zjistíme pomocí ELFO—běžně se nedělá gelová ELFO, ale kapilární ELFO doplněná chromatografií. Semtam kromě terminátoru (ddNTP) značíme i primer nebo běžné dNTP, abychom poznali, která DNA je naše nově polymerovaná a která je ta původní templátová.

Pyrosekvenování

Při syntéze DNA (konkrétně při připojení každého dNTP) se uvolňuje proton a pyrofosfát (PPi). Právě detekce uvolněného PPi se používá v rámci pyrosekvenování.

Nevýhodou této metody je, že při vyšším (8+) počtu stejných dNTP za sebou už se nám špatně detekuje jejich přesný počet. Luciferáza by mohla rozpoznat a zpracovat i běžné dATP (což nechceme), proto se použí dATP\(\alpha\)S, který má na P\(\alpha\) síru.

Odhalování metylace

Bakterie mají často své DNA nametylováno, což jim pomáhá rozpoznat virovou DNA. U savců není metylováno veškeré DNA (metylace má i regulační funkci), ale je nametylována většina (70%) CpG párů—tj. [5'] cytosin - fosfát - guanin [3'] za sebou na jednom vlákně.

Proč je CpG méně, než bychom čekali? Mohlo by to být z toho důvodu, že methylcytosin se při deaminaci (což je proces, který u DNA může probíhat) mění na thymin, zatímco běžný cytosin se mění na uracil. Uracil je totiž v DNA jednoduše detekován a rychle opraven, zatímco thymin vlastně změní informaci, kterou DNA v daném místě nese. (Metylované) CpG je tedy svým způsobem nebezpečné.

Pyrosekvenování 454

Principielně stejné jako běžné pyrosekvenování, liší se jen postupem.

Jediný hlavní rozdíl oproti pyrosekvenování je v tom, že P454 probíhá paralelně na mnoha fragmentech DNA najednou, je tedy rychlejší.

Sekvenace nanopóry

Nová metoda, stále se vylepšuje. Je rychlá, ale má vysokou chybovost (10%)—hodí se k doplnění ostatních metod.

V případě nutnosti můžeme DNA u “vchodu” do póru zpomalit nějakým proteinem, který váže DNA. Také je možné nechat projít pórem hned po prvním strandu i druhý strand, což nám dovoluje zkontrolovat chyby.

Další metody

Nezařazené poznámky

- hyperchronní efekt - ssDNA absorbuje více než dsDNA [MOODLE] SSB někdy váže DNA přes stacking interakce na Tyr nebo Trp