Obsah

1. Struktura makromolekul
   • Interakce mezi molekulami
   • Struktura proteinů
2. Nástroje
   • Rentgenová krystalografie
     • Krystalizace proteinů
     • Popis funkce
   • Kryoelektronová mikroskopie
   • NMR spektroskopie
     • NMR proteinů
   • Biomolekulární hmotnostní spektrometrie
   • Bioinformatika (výpočetní metody)
3. Enzymy
   • Karbonátlyáza
     • Lidské CA
   • HIV proteáza
   • ATP syntáza
4. Membrány
   • Lipidy
   • Membránové proteiny
     • Primární struktura
     • Sekundární struktura
     • Příklady membránových proteinů
5. Struktura DNA
   • Histony
   • Replikace
     • DNA repair
   • Transkripce
     • Splicing
     • Chromatine remodeling
   • Translace
     • Ribozom
     • Životní cyklus proteinů
6. Přenos signálu v buňce
   • Receptory
     • Fosforylace
     • G-protein-coupled receptors

Struktura makromolekul

DNA má několik forem, konkrétně především B, A a Z. Tyto se liší velikostí žlábku, tvarem ribóz a případně orientací báze (synklinální/antiklinální).

Interakce mezi molekulami

Atomy (potažmo molekuly) jsou vázány kovalentně, nebo nekovalentně.

Struktura proteinů

Proteiny jsou biopolymery složené z aminokyselin, které jsou vázané peptidickou vazbou. Peptidická vazba je ze 40% rezonanční, a proto je planární; rotace je dovolena pouze kolem chirálních \(\ce{C\alpha}\). Volnost otáčení (tzv. torzní úhly) se zaznamnává na Ramachandranův diagram.

U proteinů rozlišujeme primární až kvartení strukturu.

Nástroje

Rentgenová krystalografie

RTG používáme místo běžného světla pro jeho kratší vlnovou délku; minimální rozlišení pozorování je totiž určeno jako \(D_{min} = \frac{\lambda}{2}\) (poté již dochází k ohybu světla). Pokud se chceme dostat na atomární rozlišení \(\pu{1e10 m}\), musíme používat RTG.

Krystalizace proteinů

Jedná se o nejtěžší část RTG krystalografie. Jako srážedla se používají soli, polymery, organické látky (odebírají proteinu vodu). Přesné krystalizační podmínky nelze předpovědět, proto se dělá screening (testování 96 různých podmínek). Díky automatizaci je nyní možné na každý pokus vypotřebovat pouze malé množství proteinu.

Popis funkce

Všechna PDB data jsou tedy pouze něčí interpretace mapy elektronové hustoty. Proto je také nyní povinnost ukládat do databází kromě struktury i původní strukturní data (tedy přesnou podobu experimentálních dat), aby si každý mohl interpretaci udělat sám.

Kryoelektronová mikroskopie

Hodí se spíše pro větší vzorky; její rozlišení je omezené, ale stále se zlepšuje. V současné době se pohybuje kolem 6Å.

Kromě toho je potřeba i vysokoenergetický dým s napětím \(\pu{200}\) až \(\pu{300 kV}\).

NMR spektroskopie

Nukleární magnetická rezonance se často používá v analytické chemii, kromě toho je ale užitečná i při zjišťování struktury proteinů.

NMR malých molekul je základním nástrojem analytické chemie. V naměřených spektrech je ale více signálů a šířka čar odráží velikost systému. U komplikovanějších molekul, kde dochází k překryvu signálů, je třeba použít vícedimenzionální spektra a/nebo NMR aktivní heterojádra.

NMR biomolekul velice závisí na velikosti těchto molekul; čím je molekula větší, tím pomaleji se v roztoku pohybuje. A pomalé rotace vedou k rozšiřování čar signálů. To je zároveň největší nevýhoda NMR: systém musí být jen tak veliký, aby čáry signálů nepřesáhly šířku, za kterou už je nemůžeme analyzovat.

NMR proteinů

Právě u proteinů se objevuje problém s citlivostí NMR.

Narozdíl od RTG krystalografie pozorujeme u NMR přímou odezvu konkrétních atomů a skupin, z těchto jednoduchých dat poté můžeme sestavit model popisující interakce těchto částí. Jedná se tedy o přímé porovnání.

Biomolekulární hmotnostní spektrometrie

• pozorujeme složení, stechiometrii, vazbu malých molekul, homogenitu, čistotu
• vidíme spektra s atomárním rozlišením, zjistíme co je na molekulu připojeno (různé modifikace)
• jsme schopni separace podle iontové mobility
• velmi cenná v kombinaci s krystalografií

Bioinformatika (výpočetní metody)

Výpočetní metody studují stejné problémy jako NMR a hmotnostní spektrometrie: prostorové uspořádání molekul, jejich dynamické chování a vzájemné interakce.

Enzymy

• oxidoreduktázy (přenášejí \(\ce{H+}\) nebo \(\ce{O}\))
• transferázy
• hydrolázy
• lyázy
• isomerázy
• ligázy

Karbonátlyáza

• anglicky carbonic anhydrase (CA)
• katalyzuje reakci
  \[\ce{CO2 + H2O <=> H+ + HCO3-}\]
  • tato reakce je samovolná
• nejrychlejší enzym na světě, hydratuje \(10^6\) molekul \(\ce{CO2}\) za sekundu (zrychluje reakci \(10^7\) krát)
• pět tříd: \(\alpha, \beta, \gamma, \delta, \zeta\) (a nově objevená šestá třída \(\eta\))
  • všechny mají jako kofaktor nějaký kov (\(\ce{Zn}\), \(\ce{Mo}\), \(\ce{Cd}\))
  • v těle máme α

Lidské CA

• pomáhají udržovat acidobazické prostředí v organizmu
• účastní se \(\ce{CO2}\) a \(\ce{HCO3}\) transportu
  • respirace, resorpce kostí, glukoneogeneze, urogeneze, lipogeneze
• 16 izoforem
  • CAII
    • ve všech buňkách, je jí hodně
    • je stabilní, dobře krystalizuje
    • má dobře definované aktivní místo, od něj vede cestička k C konci vystlaná His
    • slouží jako off target: často chceme cílit léky na CAIX, ale zároveň nechceme inhibovat žádné její isoformy (to se právě těstuje na CAII)
  • CAIX: nadprodukce u nádorů, marker rakoviny, cíl vyvíjených léků

HIV proteáza

Enzym vyskytující se v retroviru HIV. V buňce se přepíše z RNA do DNA. Je jedním z hlavních cílů pro léky HIV.

Podle tvaru substrátu se vyvinula léčiva, která funkci enzymu inhibují (např. ritonavir). Deset takových inhibitorů je v klinické praxi; virus ale díky reverzní transkripci, která často chybuje, velice rychle mutuje a rychle si vyvine proti léčivu rezistenci. Tyto (primární) mutace často musí být kompenzovány mutacemi sekundárními.

primární mutace

Snižují afinitu k inhibitoru, vyskytují se především na aktivním místě.

sekundární mutace

Kompenzují efekt primárních mutací na aktivitu, zaručují, že primární mutace nebudou mít na aktivitu negativní dopad. Vyskytují se dále od aktivního místa.

ATP syntáza

• v membráně mitochondrií, chloroplastů a bakterií
• katalyzuje reakci
  \[\ce{ADP + Pi + H_{out} <=> ATP + H2O + H_{in}}\]
  • syntetizuje ATP z ADP a fosfátu, využívá k tomu protonový gradient
• dodává všem organizmům energii
• funguje trochu jako molekulární motor: \(\ce{F0}\) podjednotku v membráně pohání protony, zatímco \(\ce{F1}\) podjednotku pohání ATP
• \(\ce{F0}\) podjednotka se dá inhibovat oligomycinem

Membrány

• zajišťují tvar buněk, komunikaci, obranu, přichycení, rozpoznávání a přenos signálů
• urdžují specifické prostředí buňky: koncentraci iontů, malých metabolitů a makromolekul
• eukaryota mají membrány i uvnitř buňky
• složení
  • lipidová dvojvrstva
  • proliny
  • glycerocalyx, “cukerný obal”
  • steroly vložené v lipidové dvojvrstvě
• velmi dynamická struktura—model fluidní mozaiky
• cytoplazmatická část je negativnější než exoplazmatická

Lipidy

Lipidů je až 200 typů.

Membránové proteiny

Většina léků je založena na interakci s membránovými proteiny.

prenylace

Připojení isoprenoidů (např. farnesylu, geranyl-geranylu) k cysteinům cílového proteinu.

mytistoylace

Druh acylace. Připojení zbytku kyseliny myristové ke koncovému glycinu proteinu.

palmitoylace

Druh acylace. Připojení zbytku kyseliny palmitové na \(\ce{SH}\) skupinu cysteinu.

positive inside rule

Intracelulární rezidua mají kladnější náboj než ta extracelulární. Souvisí to se záporným nábojem vnitřní strany mebrány. Tento jev se využívá při predikci orientace proteinu.

S tímto pravidlem souvisí také jev tzv. “šnorchlování”, což je interakce polárních skupin proteinů s polárními skupinami lipidů hluboko v membráně.

Primární struktura

• aminokyselinové složení odlišné od ostatních proteinů
  • relativně vysoký obsah Gly a Pro
  • vysoké zastoupení Tyr a Trp (3x vyšší než u cytosolických proteinů)
  • vysoké zastoupení Lys a Arg v cytoplazmatické části (smyčky)
• ze sekvence lze z 98% určit, zda se jedná o membránový protein či ne
• výrazně hydrofobní transmembránové (TM) úseky o délce okolo 20AK

Sekundární struktura

Příklady membránových proteinů

Struktura DNA

Většina strukturních informací je z elektronové mikroskopie.

Obrázek makrostruktury DNA

linker DNA

DNA mezi nukleozomy, která není na nic navinutá. Mívá délku 20–30pb.

Histony

• jádro nukleozomu je proteinový oktamer složený ze čtyř párů identických histonů (H2A, H2B, H3, H4)
  • všechny tyto histony mají konkrétní strukturní motiv “histone fold”, složený ze tří helixů a dvou smyček
  • tímto histone foldem drží jednotlivé části oktameru u sebe
• namotá se na ně 164 bazí DNA ve dvou otáčkách
• mají nestrukturované konce s Lys a Arg, kde dochází k posttranslačním modifikacím
• namotané DNA nelze dobře přečíst, proto existují histonové chaperony a chaperoniny, které umí nukleozomy po DNA různě posouvat, případně je odstranit
• histon H1
  • spojuje nukleosom do solenoidu (širšího vlákna)
  • není součástí oktameru jako takového
  • interaguje s DNA (drží ji na nukleosomu)
  • má řadu regulačních funkcí
• histon H3
  • nejvíce prozkoumané modifikace

Histonové modifikace tvoří epigenetický kód, který upravuje genovou expresi nebo podává informace o DNA, jako např. informace o úrovni poškození, nebo o tom, že byl daný úsek DNA zrovna nově replikován. Tento kód je zpracováván komplexy readers a psán komplexy writers. Kromě toho může být i mazán pomocí erasers.

Replikace

Schematický obrázek replikace DNA

Aby byl systém co nejvýkonnější, dochází k velkému množství replikačních reakcí najednou.

DNA repair

• při replikaci dochází k mnoha chybám
• poškození DNA
  • chybějící báze
  • nežádoucí spojování bazí
  • kovalentně modifikované báze v určitých pozicích
• musí existovat řízený opravný mechanizmus

Proteiokináza je na místo potřeby “zavolána” KU proteinem, který našel chybu (break). Přerušené vlákno jsou poté schopny spojit ligázy.

Transkripce

Splicing

• vystřižení intronů, spojení exonů
• exony jsou různě kombinovány, pre-mRNA může být spliceována více způsoby
• začátek a konec intronu, stejně jako místo, kde se má připojit lariát (viz obrázek), mají své typické “konsenzuální” sekvence
  • tyto sekvence jsou rozpoznány spliceosomem

Schéma popisující průběh splicingu

Chromatine remodeling

• k DNA na nukleozomech není možné se dostat, je proto nutné chromatin remodelovat tak, abychom si DNA mohli přečíst
• potřeba dodat ATP
• způsoby remodelingu
  • posunutí nukleozomu
    • odhalení té části DNA, kterou potřebujeme
    • velmi energeticky náročné (překonávání elektrostatických interakcí)
  • zbavení se nukleozomu
    • díky chaperonům ale zůstává stále poblíž, “naskočí” rychle zpátky
  • zhušťování a ředění vzdálenosti nukleozomů
  • výměna histonu (nejčastěji H2)

Translace

translace

Syntéza proteinu na základě informace zakódované v mRNA. Probíhá na ribozomu.

Ribozom

• má tři významná místa
  • A místo, akceptorové místo pro nově přicházející tRNA
  • T místo, kde se váže tRNA na tvořící se polypeptidový řetězec
  • E místo, kde prázdná tRNA opouští ribozom
• první schéma už z 60.–70. let
• 2000 struktur v PDB

Životní cyklus proteinů

1. připojení AK na tRNA
2. syntéza
3. folding
4. degradace

Isoleucyl-RS je vyjímka; má dvě ak­tivní mís­ta.

• snaha zaručit, že se místo Ile nenaváže Val, který je Ile tvarem velice podobný
  • Ile je zpravid­la velice důležitý pro fold­ing pro­teinu
• do prvního místa se může navázat Ile nebo Val, do druhého jen Val
• pokud se do prvního místa naváže Val, naváže se i do druhého (obě místa jsou blízko sebe)
  • enzym si toho všimne a Val odštěpí
• pokud se do prvního místa naváže Ile, druhé místo zůstane prázdné

Přenos signálu v buňce

Receptory

Fosforylace

• nejběžnější typ posttranslační modifikace
• až 13 000 fosforylovaných proteinů, 230 fosforylačních míst
• spotřeba ATP/GTP pro přenos fosfátu na protein
• reverzibilní proces (fosfatázy)
• kinázová doména je dobře konzervovaná
• funkce
  • vytvořit interakci (fosfátová skupina interaguje přes hydroxylovou skupinu) nebo naopak interakci zabránit
  • spustit enzymatickou reakci
  • přidání náboje (fosfátová skupina je záporně nabitá)
• tyrosinová fosforylace
  • reader: SH2 doména
    • rozpoznává tyrosiny
  • writer: tyrosin kináza
    • modul, který fosforyluje
  • eraser: P-Tyr fosfatáza
    • modul, který defosforyluje

G-protein-coupled receptors

• rodina eukaryotních proteinů
• sedm transmembránových úseků
• variabilní ligandy (vůně, neurotransmitery, feromony, hormony, peptidy)
• přes 800 genů u člověka (4% všech protein-kódujících genů)
• snad každý fyziologický proces je regulován GPCR